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故書百回讀深思子自知——MIQE指南對qPCR實驗中核酸紫外測定的要求-上
在影響實時定量反應檢測靈敏度、準確性和可靠性的眾多因素中，核酸模板品質與含量無疑具有決定性作用。核酸品質（quality）是指核酸的純度（DNA/RNA、蛋白質、酚等PCR抑制劑的殘留）和完整性（Integrity）符合要求并保持穩(wěn)定。核酸的量是指用于反應的ng或μg核酸質量或拷貝數?；虮磉_定量分析中，加入相同質量的總RNA、確保每個qPCR反應孔的cDNA模板含量均一，以確保測試值真實反映mRNA 實際水平差異、排除因cDNA用量不同所致誤差。SNP基因分型檢測中模板數量過少將影響等位基因數據有效性。而NGS測序前對測序文庫模板數量均一化是保證數據質量不可或缺的質控手段。
2009年發(fā)布的定量PCR實驗數據發(fā)表所必需實驗信息最低限度標準(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) ，即MIQE指南，明確了qPCR實驗發(fā)表時作者所需提供的最低信息標準，以保證實驗數據的正確性、準確性和實驗結果的可重復性。指南從qPCR樣本的采集、處理和制備，核酸質量控制，反轉錄、qPCR體系設定及數據分析的各環(huán)節(jié)具體要求都有詳盡闡述，為全球生命科學與生物醫(yī)學的國際化標準《生物和生物醫(yī)學調查的最小信息》(Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, MIBBI)的重要組件。
本文圍繞MIQE指南的核酸質量控制環(huán)節(jié)中與微量紫外可見光度計應用有關的論述內容，結合目前學術期刊qPCR實驗文章所披露的實際操作辦法，探討如何在qPCR實驗流程核酸質控中充分發(fā)揮微量紫外可見分光光度計測定功能的問題。
一、核酸品質對實時熒光定量PCR測試性能的影響
MIQE指南中的核酸質量控制(QC of Nucleic Acids)首先是指核酸模板的完整性（integrity，是指核酸特別是RNA的降解程度）、純凈度（核酸樣品中其他核酸模板可能干擾測定結果、抑制逆轉錄活性或PCR反應的污染物的殘留情況）的評估。其次，是qPCR反應過程核酸數量的測定和控制。
1.1 完整無降解的RNA模版是qRT-PCR結果可靠性的關鍵
mRNA與機體所受內外環(huán)境條件刺激和生理狀態(tài)息息相關，其含量具高度動態(tài)性。組織器官生理結構、取樣的時間和材料的管理環(huán)節(jié)的差異同樣影響RNA的降解。降解引起的基因轉錄水平相對差異可能會對實驗結果的評價產生誤導。
在RNA完整性對RT-qPCR檢測性能影響的評價實驗中，用酶消化或紫外線處理的方法降解從牛組織中提取的完整RNA后，對18S rRNA、28S rRNA、β-Actin、IL-1b基因表達mRNA的測定結果顯示，來自同一組織的完整RNA和降解RNA樣本之間，測試值的穩(wěn)定性存在顯著差異。從高豐度18S和28S rRNA，中等豐度的β-Actin，到極低豐度的IL-1b，出現隨著RNA品質提升而mRNA樣本定量結果變異性 (intraassay variation)降低的現象。
RNA完整性具有組織細胞依賴性、時間特異性和基因特異性。一般認為，結締組織含量高的組織（如胃腸道）、富含RNase的器官（如胰臟），在取樣、存儲過程中RNA降解較高；細胞來源RNA樣品完整性要好于從實體組織提取的RNA。
研究顯示，降解RNA樣本測試數據變異存在高度的組織、基因特異性。某些組織中mRNA定量似乎不受RNA降解的影響，從部分降解的RNA樣本獲得的基因表達譜與完整RNA樣本相比，具有高度相似性。但有些組織mRNA數量與RNA質量評分指數RIN存在線性關系或存在RIN指數閾值響應關系（即部分樣品無法給出準確的測定結果）。
MIQE指南總結為：擴增片段長達400bp時，擴增效果強烈依賴于優(yōu)質RNA。而多數情況下，即便對70-250bp短擴增子qPCR測定，耐受RNA降解程度的能力也不盡相同（即RNA完整性受損不是啥好事）。定量RT-PCR分析，高品質RNA可縱橫捭闔、暢行無阻，而部分降解的RNA適合于短擴增子反應。因此，想要準確地量化組間微小表達差異，在定量分析前驗證和審視RNA質量是有益的且極其重要。
1.2 RNA品質對qRT-PCR擴增效率的影響
即使是完整RNA、優(yōu)化的引物及反應體系， 若RNA樣品中PCR抑制物濃度過高，同樣會降低qPCR檢測靈敏度和擴增效率。
通常，人們用靶基因與內參基因平行擴增和用內參對靶基因測試值歸一化的處理方法來解釋樣本間定量差異。無論相對定量還是絕對定量分析，其前體都是假設這靶、參的擴增受到相同的抑制程度。但實際情況是，部分生物樣本可能含有的PCR抑制劑，在內參樣本中不存在，而據此構建的標準曲線作為定量基準，導致測試樣本中mRNA水平低估，從而扭曲歸一化和定量分析結果。
包括生物樣品自身的天然組分、核酸提取純化操作用的試劑和實驗器具攜帶的各種化合物，凡是影響DNA聚合酶的活性，干擾模板與DNA聚合酶及引物的結合，抑制PCR擴增的化合物、鹽分，均視為為PCR抑制劑。
表1 實時熒光定量PCR實驗常見PCR反應抑制物
干擾物類型 | 污染來源 | 常見污染物 |
內源性干擾物 (endogenous interferent） | 血 液 | 血紅蛋白(>1mg/mL)，氯高鐵血紅素(Hemin) (>0.1 ng/μL)，免疫球蛋白G(IgG)； 甘油三酯（TG）、鐵離子、膽紅素等 |
動物組織 | 蛋白酶、肌紅蛋白、膠原質、黑色素、脂肪、糖原、膽汁鹽酸； 基因組DNA濃度和DNA結合蛋白等 | |
植物組織 | 腐殖酸(50ng/μL)、丹寧酸/鞣酸(Tannic acid)(0.1ng/μL)、多糖、多酚等 | |
藥 物 | 抗生素、抗病毒藥、激素類等 | |
牛奶骨頭 | 蛋白酶、ca2+等 | |
尿 液 | 尿素(>20mM) | |
糞 便 | 植物多糖、膽酸鹽等 | |
外源性干擾物 (exogenous interferent) | 提取試劑 | 硫氰酸胍、鹽酸胍、苯酚(>0.2%)、氯仿、十二烷基硫酸鈉(SDS) (>0.005%)等 |
有機溶劑 | 異丙醇(>0.15 IU/mL)、二甲基亞砜(DMSO)、甲酰胺(DMF)、甘油、聚乙二醇(PEG) ； 乙酸鈉(>5mM)、溴酚蘭等 | |
抗 凝 劑 | 肝素(>0.1U/mL)、乙二胺四乙酸(EDTA) (>0.5 mM)等 | |
消 毒 劑 | 醇類/乙醇(>1%)、酚類/苯酚(>0.2%)、過氧化物類、強酸HCL、強堿NaOH等 | |
土壤植物 | 礦物質、有機質、腐殖質等 | |
實驗器具 | 紫外線照射老化的聚丙烯材質樣品管、樣本采集容器、一次性塑膠手套上的滑石粉等 |
國外的一項專門調查表明，約6%的研究人員關注了實驗所用核酸樣本是否存在抑制劑的問題。
二、MIQE指南對qPCR實驗中微量紫外可見光度計核酸測定的要求
MIQE指南的MIQE checklist列表中，涉及到紫外可見光度計應用的是核酸提取和反轉錄兩個操作步驟。
雖然列舉的是mRNA，但其指則適用的樣品，應理解為包括全部DNA（包括基因組DNA、質粒、mtDNA、STR等）和RNA（涵蓋組織mRNA、miRNA、lnRNA、shRNA及病毒RNA等）類型樣品，應用范圍既包括核酸定量，也包攬SNP檢測應用。
表中E（essential information）標記項屬須與發(fā)表文稿一起提交的基本信息（可理解為強制要求）；而D（Desirable information）標記項為根據實驗條件盡可能提交的資料。
表2 實時熒光定量PCR實驗核酸質量控制的MIQE checklist
Item to check(應檢查的項目) | Importance |
Nucleic acid extraction（核酸提取步驟） | |
Procedure and/or instrumentation（核酸提取程序和/或所用儀器） | E |
Name of kit and details of any modifications（核酸提取試劑盒及一切操作改動） | E |
Details of DNase or RNase treatment（DNase或RNase處理的細節(jié)） | E |
Contamination assessment (DNA or RNA)（DNA或RNA污染評估過程） | E |
Nucleic acid quantification（核酸定量） | E |
Instrument and method（核酸定量所用儀器和方法） | E |
RNA integrity: method/instrument（RNA完整性檢測方法/所用儀器） | E |
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts（RNA的RIN或RQI值或Cq的3’和5’轉錄本） | E |
Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other)（PCR抑制測試情況Cq稀釋度、峰值等） | E |
Source of additional reagents used（核酸提取所用額外試劑的來源） | D |
Purity (A260/A280)（核酸的A260/A280純度檢測） | D |
Yield（核酸產量） | D |
Electrophoresis traces（凝膠電泳檢測結果） | D |
Reverse transcription（反轉錄步驟） | |
Complete reaction conditions（RT完整反應條件） | E |
Amount of RNA and reaction volume（RNA用量和反應體系體積） | E |
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration（寡核苷酸引物和濃度） | E |
Reverse transcriptase and concentration（反轉錄酶及其濃度） | E |
Temperature and time（RT反應的溫度和時間） | E |
Manufacturer of reagents and catalogue numbers（RT試劑的廠商和貨號） | D |
Storage conditions of cDNA（cDNA保存條件） | D |
Cqs with and without reverse transcription（RT后樣品和未進行RT的樣品的Cq值比較） | D |
綜合表2內容和QC of Nucleic Acids一節(jié)的論述，MIQE指南對qPCR實驗中用微量紫外可見光度計進行核酸測定的目的、要素和要求，大致可歸納為以下幾點。
2.1 核酸樣品污染情況評估
MIQE指南規(guī)定，qPCR實驗須報告所用核酸樣品中的基因組DNA/RNA、苯酚及其他PCR反應抑制劑殘留的評估情況。而紫外可見光度計的A260/A280比值測定是一簡便而重要的評估方法。其理論依據是：在中性pH溶液中測量核酸樣品，高純度的RNA溶液的A260/A280比值為2.0，而DNA這一比值為1.8，苯酚的紫外吸收峰為270nm。如RNA樣品中存在基因組DNA的混入（降低A260讀數）或苯酚殘留，抬升A280測試值，導致RNA的A260 /A280比值降低。
2.2 核酸的含量測定
在qPCR實驗要比較不同靶標定量的結果，首先要確保qPCR實驗流程幾個關鍵環(huán)節(jié)核酸樣品中的總RNA、cDNA、DNA模板用量大致相同。因此，紫外可見分光光度計A260測定核酸濃度為必選動作。
MIQE指南的有關內容有：
1）核酸（DNA/RNA）提取產量（注：測定所獲的高品質核酸OD值，根據dsDNA、RNA的μg/ μL濃度及提取物總體積計算核酸提取總產量，便于分配后續(xù)各項應用中核酸用量）；
2）反轉錄時總RNA用量（注：市面反轉錄試劑盒常建議按RT反應體系20μL：2μg總 RNA的投料比例配置RT反應體系）；
3）qPCR反應核酸模板定量（DNA/cDNA）定量（注：不同基因的cDNA合成效率不一，通常RT試劑盒無法給出cDNA產量值。A260測定獲得高品質cDNA產物濃度和總產量，便于規(guī)劃qPCR反應的cDNA用量）；
4）qPCR反應寡核苷酸引物/探針濃度測定（根據引物合成廠家配套說明和實際A260測定結果，基于cDNA投料量來優(yōu)化反應體系中引物體積用量，確保擴增效率和擴增特異性）；
5）核酸測定所用儀器及方法
指南中，NanoDrop微量紫外可見分光光度計作為把核酸定量的首選方法。低濃度RNA樣品測定則推薦熒光RNA結合染料法（如RiboGreen和Qubit 系列熒光計）。(待續(xù))
