（前續(xù)：低氧細胞實驗中三氣培養(yǎng)箱氮氣使用有效管理問題的解決方案——上） 

二、低氧細胞實驗中三氣培養(yǎng)箱的氮氣消耗途徑和流量需求

2.1 CO₂培養(yǎng)箱運行中的CO₂氣體的消耗模式分析

       研究表明，健康成年女性體內(nèi)細胞總數(shù)均值約28萬億個。平和呼吸狀態(tài)下，以潮氣量500mL、呼吸頻率12次/min計算，通氣量為6L/min。已知吸入氣體中O₂、CO₂體積占比分別為21%、0%，呼出氣體中O₂、CO₂體積占比分別為16%、4%，則每分鐘實際消耗O2和實際呼出CO₂體積分別為30mL、20mL。

       據(jù)測算，諸如Heracell VIOS 160i、CellXpert C170i、CellXpert C170和CB 170等內(nèi)部容積160-170L的CO₂培養(yǎng)箱，滿載情況下可培養(yǎng)的細胞數(shù)量不過50億個。若與人體近30萬億個細胞比，則培養(yǎng)細胞群每日所吸收O2和排放CO₂體積約均不超過10mL，可以完全忽略不計。因此，無論CO₂培養(yǎng)箱或低氧型三氣培養(yǎng)箱，在連續(xù)工作狀態(tài)下，CO₂氣體的損耗主要經(jīng)樣品存取開啟箱門時的快速逃逸和和培養(yǎng)箱通氣口CO₂分子擴散引起的緩慢泄漏這兩個途徑造成。

       據(jù)悉，一瓶40L CO₂氣氣瓶（12.5Mpa充填壓力，室溫下體積按5000L計算）對170L容積培養(yǎng)箱連續(xù)供氣約3個月，則CO₂氣體日消耗量約55L。

       實際工作中，培養(yǎng)箱內(nèi)工作空間利用率通常低于75%，以確保O₂、CO₂、水蒸汽的充分對流和箱內(nèi)溫度均一。170L CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)如有40%空間被帶蓋的各類培養(yǎng)容器填充，則剩余60%空間，約100L氣體為氣體自由流動空間，而其中CO2體積為5L。

       當箱門開啟時，隨著37℃混合氣體外逸，其中的CO₂將快速消散。箱內(nèi)CO₂濃度降低，將觸發(fā)CO₂氣體調(diào)控機制啟動而開始向箱內(nèi)輸入CO₂以試圖恢復CO₂濃度，這樣就箱門開啟狀態(tài)下，箱內(nèi)一邊輸入CO₂，新補充CO₂迅即從敞開的箱門逃逸。故箱門開啟期間，實際損失CO₂體積或超過5L。而多人共享培養(yǎng)箱的條件下，若每日集中啟閉箱門2次，則日CO₂損耗量在10L以上。箱內(nèi)裝載樣品越少，則氣體自由流動空間越大，氣體逃逸更充分；開門回合越多，因樣品操作而致CO₂損耗勢必更甚。

       細胞培養(yǎng)箱的背板上設有帶0.2μm孔徑濾器的進氣口，用于因CO₂、N2輸入而致箱內(nèi)氣壓升高時排出部分氣體以平衡箱內(nèi)外氣壓。持續(xù)運行的培養(yǎng)箱內(nèi)CO₂氣體分壓5%，而箱外空氣中CO₂這一數(shù)值近于0%。通氣孔兩側的CO₂氣體分壓差，迫使箱內(nèi)的CO₂氣體持續(xù)地以擴散方式外泄到箱外。結合55L的CO₂日耗量和每日啟閉箱門帶來的10L操作損耗數(shù)據(jù)可知，經(jīng)通氣口擴散外溢的CO₂體積每日約45L。不同型號的培養(yǎng)箱，譬如MCO-50M（容積50L）、MCO-170M（161L）、Heracell VIOS 160i（165L）、CellXpert C170i（170L）、CB 170（170L）和Heracell VIOS 250i（255L）等培養(yǎng)箱，內(nèi)部容積雖有差異，但CO₂工作濃度設定值和箱內(nèi)CO₂分壓差一致，而機箱的通氣口均為一個。因此，所有CO₂培養(yǎng)箱運行時CO₂擴散泄漏的速度大致相同。只是箱體工作容積越小，經(jīng)通氣口CO₂泄漏體積在工作總消耗量的占比更高。

       題外話：每日經(jīng)CO₂培養(yǎng)箱泄漏進入細胞間的CO₂氣體多達數(shù)十升之多，將對室內(nèi)O₂濃度產(chǎn)生持續(xù)稀釋作用。特別是當細胞間有多臺同類設備同時運行情況下，室內(nèi)CO₂大量積聚不僅造成CO₂分壓超更會導致O₂分壓降低。故細胞培養(yǎng)室應具有可靠的通風換氣條件，便于將每日培養(yǎng)箱正常運行排放的CO₂及時排出，獲得新鮮空氣的補充。避免因造成的空氣中O₂分壓下降，造成實驗人員的不適反應和對細胞培養(yǎng)結果的干擾。詳情可參考本文參考文獻中制造商官方操作指南和國家相關法規(guī)內(nèi)容。

       事實上，看似潔凈的細胞間，不僅存在“正常的”CO₂泄漏污染，優(yōu)于具有相同氣體排放機制，如使用三氣培養(yǎng)箱，還會出現(xiàn)N2泄漏污染。而我們基于對CO₂培養(yǎng)箱工作氣體的排放途徑及原理，可以測算170L的三氣培養(yǎng)箱氣體的損耗情況。

2.2 三氣培養(yǎng)箱運行中氣體消耗模式分析

       根據(jù)格雷姆氣體擴散定律（Graham's law），在相同溫度和壓力下，氣體的擴散速率與其摩爾質(zhì)量的平方根成反比。

       三氣培養(yǎng)工作氣體中，O₂、N2的分子量小于CO₂分子量。當箱內(nèi)外氣體接觸界面兩側各氣體組分的分壓差一致情況下，小分子量的O₂、N2氣體分子擴散速度會比CO₂分子更快。

       三氣培養(yǎng)箱工作條件設定為5%-O₂、5%-CO₂時，基于箱體內(nèi)外O₂、CO₂、N₂三種氣體在箱內(nèi)外接觸界面兩側的氣體分壓差、氣體擴散定律和已知CO₂分子擴散流量，可獲得如下測算結果。

表3 5% O₂含量工作條件下三氣培養(yǎng)箱工作氣體外泄擴散速度理論測算表

       170L三氣培養(yǎng)箱內(nèi)部空間利用率按40%計算，則102L自由空間全部由培養(yǎng)環(huán)境氣體充滿。

       如每日箱門需啟閉2次，則每日箱內(nèi)O₂盡流入量約200L，同時箱內(nèi)N2盡流出量約150L。為恢復箱內(nèi)O₂濃度，除應補充150L損失的N₂，還須用與流入O₂同等流量的N₂置換O₂。因此，在不考慮氣體輸入期間通氣口少量氣體泄漏損失情況下，每日須補充N₂約148+203=351L。

       根據(jù)理想氣體狀態(tài)方程（p1V1/T1＝p2V2/T2），40L氮氣鋼瓶（充裝壓力12.5MPa）。氣體升溫至37℃時，可用氣體總體積約5036L。在三氣培養(yǎng)箱連續(xù)運行過程中，40L氣瓶供氣續(xù)航時間約14.3天；如培養(yǎng)箱為多人共享每次箱門啟閉超過2次，則氣瓶供氣持續(xù)時間進一步縮短。需指出的是：（1）這一測算結果還不包括培養(yǎng)箱首次啟動時內(nèi)部氣體環(huán)境初始化過程所消耗的大量N₂；（2）測算是基于O₂濃度設定為5%這一前提進行的。如實驗中O₂濃度設定為1%，則日N₂補充流量飆升至465L，40L氮氣瓶持續(xù)供氣時間驟降至10.8天。

       有一篇原創(chuàng)作者信息、數(shù)據(jù)來源不詳?shù)木W(wǎng)文《三氣培養(yǎng)箱耗氣量到底會有多少呢？》，在眾多國產(chǎn)三氣培養(yǎng)箱廠商中流傳甚廣。文中提出：三氣培養(yǎng)箱，CO₂和O₂濃度都設定為5%時，首次開機初始化過程N2進氣量為培養(yǎng)箱容積的2倍，而運行過程維持低氧狀態(tài)所須N2則是箱體容積的4倍。故160L三氣培養(yǎng)箱開機N₂進氣量為320L，后續(xù)維持階段日耗N₂氣640L，40L氣瓶供氣時間為3.75天。不過，這個測算結果是錯誤的，而且與人們實際使用經(jīng)驗不符。

       我們假設三氣培養(yǎng)內(nèi)部容積為C（capacity，單位：升，下同）。細胞培養(yǎng)條件設定為37℃-5%濃度CO₂-5%濃度O₂。開機系統(tǒng)經(jīng)初始化過程完成箱內(nèi)空氣（0.0% CO₂：21.0% O₂：78% N2）氣體置換達到設定氣體環(huán)境條件，即：5% CO₂：5% O₂：89% N2。初始化過程輸入的CO₂體積為x，輸入N₂為y?？山⑷缦掠嬎汴P系：

5%（c+x+y）= x  ?????????????????????????????? ①

89%（c+x+y）=78%.c+y  ?????????????????????????????? ②

       求解可到5% O₂工作條件下兩種氣體初初始化過程所需氣體流量分別為x = 0.183c；y=2.483c。

如將公式②中89%用93%替換可得到：

93%（c+x+y）=78%.c+y  ?????????????????????????????? ③

       根據(jù)①、③求解可得到1% O₂工作條件下兩種氣體初始化過程所需氣體流量分別為x = 0.55c，y=9.45c。

      測算表明：

       在儀器開機初始化進程中所消耗的CO₂、N₂體積與箱體工作容積成正比。箱體容積越大，完成氣體置換所消耗氣體越多。而考慮到箱體背板上通氣口的正常氣體外泄功能后，實際消耗的CO2、N2體積數(shù)將大于上述計算值；

       相同箱體和內(nèi)部空間利用率條件下，CO₂、N₂消耗量主要由O₂工作濃度值決定。O₂濃度設定越低，則這兩種氣體消耗越大。其中N₂消耗增長速率遠高于CO₂的增長速率。5% O₂工作條件下， N2消耗量是CO₂消耗量的13.6倍。而當O₂設定為1%時，兩種氣體消耗量之比升至17.2倍。這兩種氣體更換節(jié)奏的懸殊差異，勢必給實驗氣體的管理增加了負擔；

       5% 和1% O₂濃度工作條件下，維持系統(tǒng)低氧狀態(tài)每日需輸入的N2體積并非箱體容積的4倍，而是約2.5倍和9.45倍。

2.3 三氣培養(yǎng)箱運行中N2維護所需開支的測算

       根據(jù)北京地區(qū)實驗氣體服務商提供的信息，不計氮氣瓶租借費，一次40L氮氣送氣服務收費約450元。每日箱門只開啟一個回合前提下，170L三氣培養(yǎng)箱維持5% O₂濃度持續(xù)運行期間，每半個月的N₂購氣開支為450元，而若維持1% O₂濃度運行，則每周N₂購氣支出將超1000元。

       盡管實際工作中，三氣培養(yǎng)箱常年累月連續(xù)運行的情形并不多見。但上述測算結果足以說明，當三氣培養(yǎng)箱以1%-5%的較低O₂濃度工作時，運行所需N₂消耗量之大、耗費速度之快理應值得人們重視。

      未雨綢繆，采取必要管控措施降低N₂（和CO₂）消耗，既可大幅節(jié)省實驗開支，又可化解節(jié)假日期間實驗時N2供應“青黃不接”風險。（后續(xù)：低氧細胞實驗中三氣培養(yǎng)箱氮氣使用有效管理問題的解決方案——下）